Interzellulärer Makromolekularer Transport
Der Fokus der Forschungsgruppe um Dr. Friedrich Kragler liegt auf der Charakterisierung der Transportmechanismen und Funktionen von Proteinen und RNA-Molekülen, die über die Leitungsbahnen (Vaskulatur, Phloem) zwischen Geweben ausgetauscht werden. Die Arbeitsgruppe ist insbesondere interessiert an der regulatorischen Signalfunktion mobiler mRNAs, die an der Entwicklung von Organen und Geweben, sowie insgesamt am pflanzlichen Wachstum beteiligt sind.
Viele mRNAs und Proteine exponieren Transportsignale, die deren zelluläre Verteilung bestimmen. Einige mRNAs und Proteine enthalten spezielle Sequenzen, die deren Transport über Transportkanäle (Plasmodesmata) zu Nachbarzellen und weiter über die Siebröhren (Phloem) zu entfernten Geweben ermöglichen. Plasmodesmata sind interzelluläre Kanäle, die benachbarte Pflanzenzellen verbinden. Durch diese Kanäle wird ein kontinuierliches Zytoplasma und Membransystem (=Symplasm) zwischen Pflanzenzellen gebildet. Diese Transportkanäle erlauben den Austausch zwischen den Zellen bei kleinen Molekülen mittels Diffusion und bei großen Molekülen mit Hilfe spezieller Transportsignale.
Der Arbeitsgruppe Kragler geht es in ihrer Forschung darum zu verstehen, wie der Transportmechanismus der mRNA-Moleküle funktioniert und warum sie transportiert werden. Seit langem ist bekannt, dass über das Phloem hauptsächlich Nährstoffe wie Aminosäuren, Zucker und Wachstumshormone befördert werden. Erst seit kurzem weiß man, dass auch komplexe, regulatorische RNA Moleküle im Phloemsaft transportiert werden. Es konnten alle wichtigen RNA Klassen, wie Messenger RNA (mRNA), transfer RNA (tRNA), tRNA Hälften, silencing-induced RNA (siRNA), und mikro RNA (miRNA) im Phloemsaft nachgewiesen werden. In diesem Zusammenhang gelang es der Arbeitsgruppe um Friedrich Kragler nachzuweisen, dass diese RNAs zu bestimmten Geweben gesendet werden.
Überraschenderweise konnte an gepfropften Arabidopsis Pflanzen gezeigt werden, dass ~20% der Protein-kodierenden mRNAs zwischen Blättern und Wurzeln ausgetauscht werden (Nature Plants, 2015). Weiterführende Analysen erlaubten es der Arbeitsgruppe bestimmte mobile mRNAs zu identifizieren, die ausschließlich zu Blättern, Blütenknospen oder Wurzeln gesendet werden. Auch konnte an bestimmten mRNAs gezeigt werden, dass ein tRNA-ähnliches Strukturmotiv (tRNA-like sequence, TLS, The Plant Cell, 2016) und eine sekundäre Basen-Modifikation (m5C-Methylierung) (Current Biology, 2019) deren Transport ermöglichen.
Nachweis von mobiler mRNA in Pflanzen. Eine mobile mRNA wurde mit nicht-mobiler mRNA, die ein grün-fluoreszierendes Protein (GFP/YFP) produziert, fusioniert und in Pflanzen exprimiert. In gepfropften chimären Pflanzen produzieren die Blätter dieses Fusionskonstrukt welches, falls die RNA transportiert wird, in den Wurzeln mittels Confocal-Laser-Scanning-Microscopy (CLSM) aufgespürt werden kann. Die Anwesenheit der transportierten mRNA kann auch durch Reverse Transcriptase PCR (RT-PCR) bestätigt werden.
Die Arbeitsgruppe studiert den Transportmechanismus von Makromolekülen bei A. thaliana, C. maximus (Kürbis) und Brassica (Raps) um das Pflanzenwachstum zu messen, mittels RNA-Protein, Protein-Protein Interaktionsanalysen (RIP, CoIP), Einzelzellen Transkriptomik (scRNAseq), Genom/Transkriptom Sequenzierungen, RNA Struktur-Funktion Analyseverfahren und hochauflösenden 3D Kamerasystemen.
Einzelzell-Sequenzierung. Wir verwenden Einzelzell-Sequenzierungstechniken, um die zelltypische Genexpression landwirtschaftlich wichtiger Pflanzen, wie Kohl (Gemüsekohl) oder der Modelpflanze Arabidopsis zu bestimmen. Transkripte werden in individuellen Zellen identifiziert und dieser Zelle mittels eines „Barcodes“ zugeordnet. Nachfolgende Analysen erlauben es den Transkriptomen einzelner Zellen bestimmte Gewebe und Funktionen zuzuordnen.
Die wesentlichen Fragen der Arbeitsgruppe sind:
- Welche RNAs werden in andere Zellen/Gewebe transportiert?
- Welche Faktoren regulieren den interzellularen Transport von Proteinen/ mRNAs?
- Werden mobile mRNAs in den Empfängerzellen in Proteine übersetzt?
- In welche Zellen werden welche RNAs transportiert?
- Was ist die Funktion von transportierten Proteinen und mRNAs in den Empfängerzellen?
